宁琴教授：终末期肝病合并真菌感染诊断现状与未来

２ ESLD合并真菌感染的诊断方法

ESLD合并真菌感染的诊断主要依据真菌微生物学检查证据、宿主因素及临床表现，分为确诊、临床诊断、拟诊3类^［14］。临床确诊主要依据真菌微生物学检查结果，但阳性检出率尚不能满足临床需要，相关替代检验指标受到ESLD影响，其具体临床应用需进一步优化。

2.1微生物培养

念珠菌血症的金标准是血培养，但其灵敏度为63％～83％^［15］。原因可能是血液中缺乏活念珠菌、活念珠菌浓度不足以在收集的样本中检测到或活细胞间歇性/短暂释放到血液中^［16］。念珠菌的繁殖速度慢，其培养阳性时间需要72~96h。

深部念珠菌病诊断的金标准是无菌收集的感染组织培养物（胸腔积液、腹腔积液、脑脊液等）培养阳性。直接从感染培养念珠菌的深部部位采集样本，往往需要侵入性操作，组织培养敏感性低于50％^［16］，这可能与念珠菌浓度低、分布不均有关。

IA最常见的类型为IPA，通过痰培养或支气管肺泡灌洗术（BAL）获得的呼吸道标本培养是诊断的金标准，但是该方法存在以下问题：标本不易获得，获取标本常需要侵入性操作（支气管肺泡灌洗、肺活检、支气管活检等）。通过痰培养或BAL获得的呼吸道标本培养的阳性预测值较低（约72％），在已经接受抗真菌治疗的患者中可能更低^［17］。BAL培养阳性可能反应的是定植而不是感染。

使用微生物培养来诊断IFI存在敏感性差、耗时长、标本难以获取、难以区分定植与感染等问题，不宜作为早期诊断的手段，诊断时进行治疗往往为时已晚。ESLD患者出现抗菌治疗无效的发热/寒战、胆红素不降反升等临床表现时，积极连续留取足量血液和体液标本（痰液、腹水、胆汁等），并及时处理以防止细菌和酵母菌过度生长，必要时使用特定培养基/特殊染色以提高IFI的诊断准确率。

2.2特殊染色检查

显微镜检查是诊断IFI的方法之一，但是该检查的敏感性低，主要因为其需要更高的真菌丰度^［18］。荧光染料（如Calcofluor WhiteTM或BLancophorTM）染色具有灵敏度高、周期短和适用性广等优点，但对曲霉菌的染色不具有特异性。Gomori的乌洛托品银染和高碘酸希夫可用于组织学切片和涂片，可应用于IA的诊断。

2.3特异性抗原检测

真菌特异性抗原检测^［19］，简称G试验，是基于血清中（1,3）-β-Ｄ-葡聚糖（BDG）的检测方法。BDG是真菌（念珠菌、曲霉菌、耶氏肺孢子虫等）的细胞壁成分，但在毛霉菌和大多数隐球菌中并不存在，在细菌、病毒以及哺乳动物中也不表达。成人BDG≥80pg/ml被定义为阳性。虽然G试验能够用于IFI的诊断及抗真菌治疗疗效评估，其缺点也不容忽视：无法用于隐球菌诊断、不能鉴定具体的菌属和菌种以及假阳性高。既往研究显示，G试验假阳性的原因可能与人血液制品输入（免疫球蛋白、白蛋白）、纤维素膜血液透析、使用阿莫西林克拉维酸或哌拉西林-他唑巴坦等抗生素、严重细菌感染、肠内营养等因素有关^［20］。

血清曲霉特异性抗原检测，简称GM试验。半乳甘露聚糖是曲霉菌属的细胞壁成分，真菌生长和侵入组织时释放，可通过平板曲霉酶免疫测定检测。GM≥0.5ng/ml被定义为GM试验阳性，被认为是曲霉菌病的真菌学证据，但易出现假阳性反应。当接受阿莫西林-克拉维酸和哌拉西林-他唑巴坦、含葡萄糖酸盐的血浆、血液衍生产品治疗，或与其他霉菌和二态性真菌（例如青霉菌等）发生交叉反应可致假阳性，无法用于毛霉菌的诊断^［21］。

ESLD常使用抗生素治疗，住院期间输入血制品（人工肝治疗、白蛋白、血浆等），将会影响ESLD患者G/GM试验诊断特异性。可在患者入院后动态观察血液G/GM试验检验结果，以降低该检查的假阳性率。一项ACLF合并IFI的回顾性分析显示，BDG和GM诊断IFI的灵敏度、特异性和曲线下面积分别为97.4％、60.0％、0.770和43.6％、100％、0.745^［4］。

G/GM试验联合检测能更好地排除假阳性，有助于IA的诊断。一项荟萃分析评估了G/GM联合试验在免疫功能低下的成年IA者中的诊断效用，结果显示，虽然敏感性降低为49％，但其特异性为98％^［22］。由此可见，同时检测G/GM试验可提高诊断IA的特异性。

2.4分子检验

聚合酶链式反应（PCR）作为IFI的辅助诊断手段，可用于检测全血、血清、血浆、脑脊液或BAL中的真菌，为鉴定对抗真菌治疗有耐药性的真菌菌株提供了一种非培养替代方法，与其他诊断方法相结合可以提高IFI的诊断效能，同时也是毛霉菌唯一的非培养实验室检测方法^［23］。该技术目前最主要的问题是标准化程度有限，检测到死亡微生物的DNA易致临床假阳性结果。PCR连续阳性对IA的诊断具有良好的特异性，但尚未在ESLD患者中验证。

2.5宏基因组二代测序（mNGS）

mNGS也称为高通量测序，它可以应用于各种标本类型，包括血液、支气管肺泡灌洗液、脑脊液、痰液、尿液等。它仅需从样本中提取少量的脱氧核糖核酸（DNA）/核糖核酸（RNA），便可以检测和鉴定病原体，可检测出罕见、新型、难以检测的病原体，同时具备耐药性评估的能力^［24］。但mNGS的超灵敏性会导致病原体与其他微生物（背景菌群、污染菌群、定植菌群）的鉴别困难，从而使得临床解读缺乏标准。伴有感染性腹水的ESLD患者，由于肠道菌群改变、细菌易位等因素，使得mNGS难以发挥其高效、快速的检测价值^［25］。

2.6其他检测方法

T2念珠菌纳米诊断组合使用T2磁共振和专用仪器平台直接扩增和检测（使用带有靶探针的纳米颗粒）全血中的念珠菌DNA，即使患者正在接受抗真菌治疗，该技术仍能灵敏检测出念珠菌^［26］。该方法可以在大约5h内从全血中快速识别出5种最普遍的念珠菌（白色念珠菌、热带念珠菌、副念珠菌、克鲁塞念珠菌和光滑念珠菌）和无法检测到少量的耳念珠菌^［27］。T2念珠菌纳米诊断组合与传统血培养技术相结合可以显著提升IC的诊断效率，但其诊断效能仍有待验证。

曲霉特异性侧流装置（LFD）是一种免疫层析测试，它使用JF5单克隆抗体检测活跃生长的曲霉菌分泌的细胞外糖蛋白（甘露蛋白）抗原。LFD用于BAL样本诊断IPA受全身性抗真菌预防/治疗的影响较小，但仍需更多的临床样本进行验证^［29］。